Wywołane promieniowaniem gamma wahania pigmentacji melaniny w kutikuli larwalnej ćmy migdałowej Ephestia cautella

Pomiar melaniny u nienapromieniowanych i napromieniowanych larw ćmy migdałowej w 4. stadium larwalnym, Ephestia cautella

Nienapromieniowane larwy w czwartym stadium larwalnym Ephestia cautella wykazywały silną melanizację po uśmierceniu przez zamrożenie. Rysunek 1 pokazuje kolor E. cautella Larwy przy różnych dawkach promieniowania gamma. Kiedy larwy w czwartym stadium rozwojowym zostały napromieniowane różnymi dawkami (0, 200, 400, 600, 800 i 1000 Gy) i zabite przez zamrożenie po tygodniu od ekspozycji na promieniowanie gamma, larwy kontrolne uległy znacznej melanizacji, a następnie stały się czarne ( Ryc. 1A). Stopień melanizacji u larw napromieniowanych różnił się istotnie od stopnia melanizacji u larw nienapromieniowanych i generalnie zmniejszał się wraz ze wzrostem dawki. Larwy napromieniowane 200 Gy wykazywały podobną melanizację jak kontrola, chociaż czarny kolor rósł wolniej (ryc. 1B). Larwy napromieniowane energią 400 i 600 Gy były koloru od ciemnoszarego do jasnoszarego (ryc. 1C, D). Większość larw napromieniowanych energią 800 Gy wykazywała wyraźny brak melanizacji (naturalnego zabarwienia) lub była tylko częściowo melanizowana i wydawała się mniejsza niż larwy kontrolne (ryc. 1E). Największą supresję melanizacji zaobserwowano u larw napromieniowanych energią 1000 Gy. Larwy miały jedynie całkowicie naturalny kolor (kremowy) (ryc. 1F).

Wskaźnik melanizacji dla larw nienapromieniowanych i napromieniowanych Ephestia cautella

Larwy kontrolne w czwartym stadium rozwoju E. cautella wykazały ciemnienie ich ciała. Natomiast w grupie kontrolnej stwierdzono wysoką wartość wskaźnika melaniny (100%) (tab. 1). Liczba larw niezmelanizowanych i larw wykazujących łagodną melanizację wykazywała tendencję do zwiększania się po ekspozycji na dawki promieniowania. Ciemnienie larw zabitych przez zamrożenie po jednym tygodniu napromieniania dawkami 200, 400, 600, 800 i 1000 Gy zmniejszyło się ze 100% w kontroli do odpowiednio 93,2, 57,2, 37,4, 26,4 i 0%.

Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie dawki promieniowania charakteryzowały się istotnie niższym poziomem melaniny w porównaniu z grupą kontrolną i dawką 200 Gy, co wskazuje na istotny hamujący wpływ promieniowania na ten proces. (Tabela 1).

Aktywność fenoloksydazy u larw nienapromieniowanych i napromieniowanych Ephestia cautella

Wyniki doświadczenia dotyczącego wpływu promieniowania na oksydazę fenolową u larw larw E. cautella wskazują na zmienność odpowiedzi aktywności enzymu na napromieniowanie (tab. 2 i ryc. 2). Aktywność fenoloksydazy u napromienianych larw w dawkach 200, 400 i 800 Gy była podobna jak w grupie kontrolnej, natomiast w dawkach 600 i 1000 Gy aktywność fenoloksydazy wzrosła odpowiednio do 14,92 i 13,37 jednostek OD w porównaniu z 8,81 jednostek OD w kontrola.

Wpływ promieniowania gamma na aktywność fenoloksydazy u larw Ephestia cautella.

Wpływ promieniowania gamma na łuski włosa Ephestia cautella Larwy:

Aby określić, które warstwy naskórka zawierają granulki melaniny oraz jak są ułożone i ukształtowane poszczególne warstwy naskórka, przeprowadza się badania histologiczne naskórka brzucha E. cautella Zbadano larwy w czwartym stadium rozwojowym. Przekroje poprzeczne próbek naskórka brzucha wykazały, że ściana ciała składa się z trzech warstw (naskórka, naskórka i błony podstawnej). Naskórek jest najgrubszą, najbardziej zewnętrzną warstwą skóry wydzielaną przez naskórek. Składa się z dwóch warstw (naskórka i prokutikuli), przy czym prokutikula składa się z warstwy zewnątrznaskórkowej i wewnątrznaskórkowej (ryc. 3).

Przekrój poprzeczny Ephestia cautella Larwa w czwartym stadium larwalnym z różnymi warstwami naskórka, naskórka i błony podstawnej. (H&E X 400).

Badanie mikroskopowe nienapromieniowanych larw E. cautella ujawniło, że ziarna brązowego pigmentu melaniny odkładały się w warstwach naskórkowych i zewnątrznaskórkowych naskórka (ryc. 4A). Kiedy larwy poddano działaniu dawek promieniowania gamma, ilość pigmentu melaniny stopniowo malała, aż w końcu zniknął on z warstw naskórka przy wyższych dawkach (1000 Gy).

Przekrój poprzeczny Efezja kutella Larwy w czwartym stadium rozwojowym pokazują wpływ promieniowania gamma na naskórek, a strzałki wskazują warstwy zawierające granulki pigmentu melaniny. (Epi: naskórek; Exo: egzokutykula). (H&E X 400).

Przy dawce 200 Gy larwy wykazują bladobrązową, jednorodną warstwę pigmentu melaninowego ograniczoną do warstwy naskórkowej naskórka. Egzokutyka stała się cienką warstwą brązowego, jednorodnego pigmentu melaninowego rozłożonego w całej tej warstwie (ryc. 4B). Po zwiększeniu dawki do 400 i 600 Gy ziarnistości melaniny pojawiały się jedynie w warstwie naskórkowej i występowało silne stężenie brązowych granulek, szczególnie osadzonych na końcach (ryc. 4C i D). Larwy poddane działaniu energii 800 Gy wykazywały bladą, ciemną warstwę melaniny ograniczoną do niektórych obszarów warstwy naskórkowej, natomiast przy wyższej dawce 1000 Gy granulki melaniny zniknęły ze wszystkich warstw (ryc. 4E i F).

Idealna metoda wykrywania napromieniowanych owadów powinna (1) być specyficzna dla napromieniowania i nie mieć na nią wpływu inne procesy, (2) być dokładna i powtarzalna, (3) mieć granicę wykrywalności poniżej minimalnej dawki, jaką można zastosować w przypadku zastosowany produkt rolny jest zabiegiem kwarantannowym, (4) ma zastosowanie wobec szeregu agrofagów, (5) jest szybki i łatwy w stosowaniu oraz (6) umożliwia oszacowanie dawki napromieniowania²⁹. Stosowany tu test melaninowy do wykrywania napromieniowanych larw szkodników przechowywanych nie spełnia tych wymagań. Testy często dawały niespójne wyniki, ponieważ (a) napromienianie nie zapobiega całkowicie melanizacji larw szkodników oraz (b) nietraktowane larwy zabijane na zimno i badane w temperaturze pokojowej często wykazywały niepełną melanizację. Zaobserwowaliśmy nieleczone owady, które wykazywały wyraźny brak melanizacji (naturalnego koloru) lub były tylko częściowo melanizowane, często podobnie jak te, które zostały napromieniowane.

Według Nation i in.¹⁰Promieniowanie jonizujące może silnie hamować melanizację niektórych larw szkodników w wystarczających dawkach, ponieważ zapobiega wytwarzaniu jednego lub większej liczby enzymów związanych z melanizacją, zamiast zmieniać reakcje enzymatyczne prowadzące do melanizacji. Odkryli, że po zamrożeniu i rozmrożeniu kontrolowano larwy karaibskiej muszki owocowej Anastrefa zawieszona szybko zrobił się brązowy. Wczesne stadia szkodnika napromieniowano >20 Gy i zbadano pod kątem całkowitej melanizacji, natomiast późne trzecie stadia wyblakły i wykazywały typową melanizację. Ich wyniki potwierdzili Mansour i Franz³⁰ Ich praca nie dostarcza jednak danych na temat odsetka napromieniowanych i nienapromieniowanych larw, które przeszły proces oraz odsetka ich ciał objętych melanizacją. Wyniki niniejszej pracy jednoznacznie wskazują, że promieniowanie gamma larw szkodników magazynowych hamuje ich melanizację, ale nie zapobiega całkowicie temu procesowi.

Banasik-Solgala i Stanisław³¹ odkryli, że poziom melanizacji różnił się znacząco pomiędzy owadami leczonymi i nieleczonymi. U starych larw ćmy mącznika indyjskiego zmniejszał się wraz ze zwiększaniem dawki po leczeniu. Plodia interpunctellaśródziemnomorska ćma mączna, Ephestia (Anagasta) kuehniellai ćma migdałowa, Cadra Cautella. Ignatowicza i Ibrahima³² donoszą, że po napromieniowaniu młode larwy mącznika mącznego, Tribolium confusummelanizacja uległa zmniejszeniu w pierwszym tygodniu. Duże różnice w pigmentacji melaniny u nietraktowanych starych larw częściowo przesłaniały wpływ promieniowania gamma na ten proces. Jednakże we wszystkich doświadczeniach ze starymi larwami melanizacja była znacznie zmniejszona. Ignatowicza i Katarzyny³³ pierwsza i druga larwa chrząszcza Khapra, Granarium trogodermy doświadczyło znacznego zahamowania procesu melanizacji po radioterapii dawkami od 100 do 500 Gy, co było spowodowane zamrożeniem w 1. dobie^ul i 2^II tydzień po radioterapii. Naświetlanie również znacząco hamowało melanizację 4. warstwy^Cz stadium larwalne po śmierci; Jednakże ze względu na duże różnice w sposobie, w jaki proces melanizacji reaguje na napromienianie, zmiany w melanizacji larw chrząszcza Khapra nie można traktować jako oznaki wcześniejszego napromieniania tych owadów. Ponieważ aktywność fenoloksydazy wzrasta wraz z rozwojem larw i osiąga maksimum na krótko przed przepoczwarzeniem, wydaje się, że larwy mają wysoki poziom enzymu^30.34. Ponieważ dojrzałe larwy są nasycone enzymem, nie reagują na napromienianie tak wyraźnie, jak larwy, które zostały napromieniowane jako larwy niedojrzałe^4,10,30. Może to wyjaśniać różne wyniki uzyskane w przypadku starych larw.

Ćma migdałowa, E. cautellawykazali skrajnie różną aktywność enzymu fenoloksydazy zarówno u larw kontrolnych, jak i napromienianych, co sugeruje, że inne, jeszcze niezidentyfikowane czynniki mogą wpływać na aktywność enzymu. Należy zidentyfikować te czynniki. Dlatego w procesie kwarantanny nie można jeszcze zastosować testu opartego na aktywności oksydazy fenolowej z wystarczającą dokładnością, aby zidentyfikować nienapromieniowane owady, które są szkodnikami produktów magazynowych.

Zdjęcia z mikroskopu świetlnego pokazały, jak skórki larw zmieniły kolor podczas procesu melanizacji. Nasze wyniki sugerują, że za czarny kolor naskórka odpowiada odkładanie się czarnych granulek podobnych do melaniny w warstwach naskórkowych i zewnątrznaskórkowych E. cautella larwy. Wykazano to na skórkach larw Lepidoptera³⁵. Jednakże poprzednie dochodzenie ujawniło, że czarna zmutowana larwa Bicyclus Annana W naskórku nie było granulek melaniny, a naskórek wydawał się mieć jednorodną powłokę ciemnego pigmentu w dystalnej części³⁶. W związku z tym metody czarnej pigmentacji w kutikuli larw różnych gatunków motyli mogą się różnić w zależności od tych cech strukturalnych^35.36. Za czarny kolor korpusu odpowiedzialne są przede wszystkim złogi melaniny w skórkach. Melanina jest wytwarzana przez komórki naskórka na drodze syntezy melaniny^37,38.